Карта Research Ideas/Todos
Живой список направлений, экспериментов и открытых вопросов epiCme — не окончательный план, а рабочая доска, которая растёт по мере прогресса. Первый раздел ниже фокусируется на самом насущном: как экспериментально провалидировать гипотезы о транскрипционных факторах, вышедшие из ChIP-seq анализа K562.
Валидация TF-гипотез: от корреляции ChIP-seq к причинности
Публичные ENCODE ChIP-seq треки для K562 показали, что CTCF и NRF1 — единственные из подтверждённых в локусе факторов с прямой литературной поддержкой метилчувствительного связывания — сидят прямо внутри значимого дифференциального CpG-кластера (CTCF: CpG #43–86, NRF1: CpG #13–43). Но это данные из несортированной, немодифицированной K562-популяции ENCODE — не из наших CD55-LOW/HIGH фракций. Ниже — конкретные эксперименты, которые превратили бы эту гипотезу в проверяемый, а затем и в доказанный механизм.
chr1:207,318,092–207,324,450, что и приводит к молчанию гена — а не просто коррелирует с ним.
Совместное считывание метилирования и занятости TF на одной молекуле (single-molecule joint readout)
Обработать хроматин GpC-метилтрансферазой (M.CviPI) перед пробоподготовкой Nanopore — она метит только доступные, не занятые белком GC-мотивы, оставляя нетронутыми занятые/закрытые участки. В сочетании с уже читаемым нативным CpG-метилированием это даёт на каждой отдельной молекуле сразу два ответа: метилирован ли CTCF/NRF1-мотив, и занят ли он белком прямо здесь и сейчас (это техника из семейства dSMF / Fiber-seq, адаптированная под long-read).
Это единственный из перечисленных экспериментов, который проверяет гипотезу ровно на том уровне, на котором уже устроен весь пайплайн epiCme (per-molecule токенизация вместо усреднённого bulk-сигнала) — и не требует сортировки LOW/HIGH фракций отдельно: гетерогенность видна прямо внутри одной популяции, молекула за молекулой.
Стоимость входа: один новый ферментативный шаг перед библиотечной подготовкой, протокол уже опубликован для long-read платформ — умеренный, но не тривиальный wet-lab lift.
CUT&RUN на CTCF и NRF1 в отсортированных CD55-LOW / CD55-HIGH фракциях
Tier 1Что проверяет
Прямую версию гипотезы «вытеснения» — но уже в тех самых клетках, где мы видим сигнал метилирования, а не в смешанной ENCODE-популяции. Это главный концептуальный разрыв текущего ChIP-seq анализа, и его закрытие — самый очевидный следующий шаг.
Почему это сильно продвигает
Даёт первую прямую (не выведенную из литературы) причинно-следственную привязку: конкретный CpG-кластер → occupancy конкретного TF → фенотип молчания — на одном и том же локусе, в одном эксперименте.
Реализуемость
CUT&RUN работает на low input (~100–500 тыс. клеток) — совместим с уже FACS-отсортированными фракциями без дополнительного культивирования; антитела к CTCF и NRF1 широко валидированы (ENCODE-grade), риск по реагентам низкий.
In vitro биохимия: EMSA / biolayer interferometry на метилированных vs неметилированных олигодуплексах CD55-мотивов
Tier 1Что проверяет
Чисто биофизический вопрос: падает ли аффинность связывания рекомбинантного CTCF/NRF1 (или их ДНК-связывающих доменов) при CpG-метилировании именно того мотива, который реально присутствует в CD55-промоторе — не обобщённого consensus-мотива из литературы.
Почему это сильно продвигает
Убирает все клеточные confounders (хроматин-контекст, другие факторы, кинетика ремоделинга) — чистый да/нет ответ, чувствителен ли именно этот мотив в этом локусе, без всех остальных слоёв клеточной сложности.
Реализуемость
Рекомбинантные белки/домены доступны коммерчески или через сотрудничество; синтез коротких мет./немет. дуплексов — рутинная услуга; можно делать полностью без клеточной культуры, параллельно с остальными экспериментами.
ATAC-seq в отсортированных фракциях как быстрый corroborating readout
Tier 1Что проверяет
Падает ли доступность хроматина в CpG-кластере #20–132 синхронно с ростом метилирования в CD55-HIGH — независимая от антител линия доказательств, что этот регион теряет функциональную открытость, а не только несёт метку метилирования.
Почему это сильно продвигает
Быстрый и дешёвый способ отличить «метилирование как побочный маркер» от «метилирование как часть реального закрытия хроматина» — минимальный риск, максимальная скорость получения ответа.
Реализуемость
Не требует антител или оптимизации; можно делать на тех же отсортированных клетках параллельно с CUT&RUN, используя уже существующий FACS-протокол.
Генетическая эпистазия: degron/нокдаун CTCF и NRF1 в K562 перед CRISPRoff/ZFPoff
Tier 2Что проверяет
Причинную необходимость: если CTCF/NRF1 — реальные downstream-эффекторы метилирования на пути к молчанию CD55, их острая потеря до редактирования должна изменить фенотип. Полный нокаут CTCF часто летален/плейотропен — предпочтителен обратимый degron (auxin-inducible degron, dTAG) для острого истощения без компенсаторных эффектов.
Почему это сильно продвигает
Генетика — золотой стандарт причинности в биологии; дополняет корреляционный ChIP-seq и ацеллюлярную биохимию третьей, ортогональной линией доказательств.
Реализуемость
Degron-линии K562 для CTCF описаны в литературе и потенциально доступны через сотрудничество; требует более длительной настройки клеточной модели, чем Tier 1 эксперименты.
Кинетика: ранние временные точки (Day 1–2–4) с параллельным метилированием + CUT&RUN + экспрессией
Tier 2Что проверяет
Временной порядок событий: метилирование растёт раньше потери occupancy TF, или наоборот? Обе модели механистически осмысленны — TF-потеря может открывать доступ для de novo DNMT так же легко, как метилирование может вытеснять TF. Разделить их можно только кинетикой.
Почему это сильно продвигает
Сейчас у нас есть только отдельные снимки (Day 16 K562, Day 35 T-клетки) — без временного ряда причинная стрелка в принципе не определима, какие бы корреляции мы ни находили.
Реализуемость
Требует повторения тайм-курса редактирования с более частым забором точек — логистически посильно с существующим ZFPoff/CRISPRoff протоколом, но добавляет объём работы кратно числу точек.
Motif-resolution эпигенетическое редактирование: таргетировать не весь промотор, а именно CTCF- или NRF1-кластер
Tier 3Что проверяет
Достаточность/необходимость именно этого узкого CpG-кластера (а не всего промотора целиком) для молчания CD55 — направить CRISPRoff/ZFPoff/dCas9-TET1 узко, на CpG #43–86 (CTCF) или #13–43 (NRF1) по отдельности, вместо широкого покрытия всего промотора.
Почему это сильно продвигает
Переход от «промотор в целом метилирован → ген молчит» к «именно этот CpG-кластер, связанный с занятостью конкретного TF, функциональный драйвер» — уровень механистической детализации, редко достижимый в epigenome editing литературе, и прямой мост к общему вопросу «как устроена регуляция клеток», не только к CD55.
Реализуемость
Требует дизайна нового, более короткого guide/ZFP, нацеленного именно на подрегион — технически посильно на существующей платформе, но это новая итерация дизайна, а не переиспользование текущих реагентов.
Парное single-cell считывание: поверхностная экспрессия CD55 + метилирование + (в перспективе) TF occupancy
Tier 3Что проверяет
Расширяет уже существующий open todo (прямое парное измерение CD55 surface expression + метилирования, вместо вывода направления из модели сортировки) — добавляя третье измерение: occupancy TF на тех же клетках, если методика из пункта 1 или флагманского эксперимента станет рутинной.
Почему это сильно продвигает
Закрывает последний остающийся разрыв между «мы выводим направление эффекта из модели» и «мы видим все три переменные одновременно на одной клетке» — самый строгий из возможных здесь стандартов доказательства.
Реализуемость
Наиболее амбициозный пункт списка — зависит от созревания методик из Tier 1–2 выше; разумно вернуться к нему после первых результатов CUT&RUN и/или флагманского эксперимента.
Другие направления (заготовки — будут расширены отдельно)
Этот раздел — просто список названий, чтобы ничего не потерялось. Разворачивать их в полноценные подразделы будем по одному, когда до них дойдёт очередь — не пытаемся продумать всё сразу.
- Добавление ZFPoff как третьей модальности редактирования на сайте (нужен three-way group selector в UI)
- Мультитаймпоинт / мультидонорный анализ (Day 6, Day 28, Day 35) — честная документация confound между donor и timepoint
- Off-target профилирование метилирования по уже существующим глубоким ONT-прогонам
- Data upload & analysis service — вопросы к научрукам про аудиторию, реальный бэкенд и приоритизацию