Синтетический ROI CD55: baseline для калибровки
ONT-калла метилирования и его смещений
Дизайн-документ (пока без данных): как построить контрольную конструкцию, покрывающую наш регион интереса CD55, с заранее известным статусом метилирования — чтобы отделить настоящий биологический сигнал от смещений (bias) базовызывания и мС-калла нанопора на этом конкретном участке генома.
Зачем нужен синтетический baseline
ONT-базовызывание и вызов 5mC — вероятностные модели, обученные на определённых контекстах k-mer. Их точность зависит от локальной последовательности: часть CpG в нашем ROI может систематически недо- или переоцениваться независимо от реальной биологии редактирования. Мы уже видели один такой артефакт на существующих данных.
Ground-truth контроль — единственный способ количественно отделить: (а) реальный биологический эффект CRISPRoff / ZFPoff, (б) артефакт фильтрации данных, (в) собственное смещение калла ONT по позиции/контексту CpG.
Регион интереса
Та же 6 500 п.н. область CD55, 137 CpG, что и во всех остальных анализах на сайте — синтетическая конструкция должна покрывать именно её, чтобы контроль и реальные образцы прошли через идентичный контекст последовательности.
Три контрольные конструкции
Одна и та же последовательность ROI, три заранее известных статуса метилирования.
Полностью неметилированная
ПЦР-продукт с тех же праймеров, что и на реальных образцах (или WGA-амплификация) — ДНК-полимераза не переносит 5mC, поэтому продукт неметилирован по построению.
Полностью метилированная
Тот же ПЦР-продукт, обработанный CpG-метилтрансферазой M.SssI + SAM in vitro. Полноту метилирования нужно подтвердить независимо (см. чек-лист) — предполагать «~100%» без проверки нельзя.
Мозаичная / паттерн-контроль
Опционально: смесь известных долей конструкций (а) и (б) на молекулу, либо синтезированный фрагмент с чередующимися блоками meth/unmeth — тест на калл вблизи «границ» перехода статуса, не только на глобально однородных состояниях.
TODO: план эксперимента
Мокрая лаборатория → секвенирование → анализ. Ничего из этого ещё не выполнено.
- Зафиксировать последовательность ROI — взять тот же ампликон/праймеры, что уже используются для реальных Day 6 / Day 35 образцов, чтобы контекст последовательности был идентичен.
- Получить ПЦР-продукт ROI высокоточной полимеразой (низкая ошибка синтеза важна — иначе полимеразные ошибки спутаются с калл-ошибками ONT).
- Разделить на аликвоты: (а) без обработки — неметилированный контроль; (б) обработать M.SssI + SAM — полностью метилированный контроль.Опционально (в): мозаичный/паттерн-контроль (см. выше), если синтез участка с заданным паттерном экономически оправдан на 6.5 т.п.н.
- Независимо подтвердить полноту метилирования (б) — рестрикционным анализом (HpaII/MspI) или EM-seq/бисульфитным подтверждением на подвыборке, до того как доверять конструкции как «ground truth ~100%».
- Баркодировать и заспайковать оба (или три) контроля в тот же прогон ONT, что и реальные образцы — тот же flow cell, та же химия, тот же прогон базовызывания.
- Секвенировать на сопоставимой глубине с числом молекул реальных групп (N), чтобы статистика калла была сравнимой.
- Прогнать тот же пайплайн калла, что и на реальных данных, на обоих порогах —
0.7 (permissive)и0.995 (strict). - Посчитать per-CpG вызванную долю метилирования для каждого контроля и сравнить с ground truth (0% / ~100%).
- Найти позиционные и контекстные смещения — по номеру CpG, по фланкирующему k-mer — есть ли сайты, которые систематически недо-/перекалливаются.
- Сверить с уже известным NT vs EM-seq расхождением — тест на неметилированном контроле напрямую покажет, объясняется ли завышение NT-baseline фильтром NoFullyUnmeth или собственным смещением ONT-калла.
- Threshold-sensitivity на контролях — по аналогии с уже сделанным на K562 (корреляция профиля 0.7 vs 0.995), проверить то же самое на синтетике.
- Честно задокументировать результат — если смещение мало, это усиливает доверие к реальным каллам; если оно CpG-позиционно-специфично, предложить коэффициент коррекции или список исключаемых CpG для будущих анализов.