EM-seq на Day 35 — другая химия, тот же донор
Nanopore-данные Day 35 (страница «Day 35») — прямые одномолекульные вызовы метилирования. Эта страница — независимая проверка того же донора и той же временной точки другим методом: EM-seq (ферментативная, не-бисульфитная конвертация + короткое прочтение), без вызова с одной молекулы, зато с очень глубоким покрытием на ампликон.
Дизайн эксперимента
Один донор на все 10 образцов. Три условия, у каждого — биологические и технические реплики (расшифровка ниже) — видно на IGV-скриншоте с покрытием по каждому баркоду.
NT — нетаргетный контроль
Биологические реплики 1 и 3, тот же донор — по 2 технических EM-seq прогона на каждую.
CRISPRoff — редактированные
Биологическая реплика 1, тот же донор, что и на странице «Day 35» — 2 технических прогона.
ZFPoff — вторая система редактирования
Биологические реплики 1 и 3, тот же донор — по 2 технических прогона на каждую, независимая проверка вторым молчащим инструментом.
91 CpG-позиции на ампликоне (33–1450 п.н. внутри прочтения) — подмножество полного окна анализа Nanopore-страниц (137 CpG), не 1:1 совпадающая нумерация. Покрытие на позицию: Coff ≈ 800–840×, ZFPoff ≈ 1800–3300×, NT неравномерно (39–48× у пары 1B против 800–1400× у 3B — см. оговорку ниже).
Что означают цифры и буквы в именах образцов
Имя образца устроено как ТИП_N[Буква].M — три независимых уровня, каждый со своим смыслом:
- N (цифра после «_») — биологическая реплика. У этого донора на Day 0 клетки разделили на параллельные культуры (биологические реплики 1, 2, 3), и каждую параллельную культуру растили под все три типа воздействия сразу: (i) NT = нетаргетный контроль, фейковая электропорация без действующих реагентов редактирования, (ii) CRISPRoff = KRAB+dCas9+DNMT, (iii) ZFPoff = KRAB+ZFP+DNMT — те же домены молчания, но другой способ прицеливания на ДНК (dCas9+sgRNA против ZFP). В этом EM-seq-прогоне есть данные по репликам 1 и 3 (не по всем трём — реплика 2 в этот раунд не попала).
- Буква (A или B) после N — разделение на пробирки. Клетки, извлечённые из одной биологической реплики, развели по двум максимально совпадающим пробиркам. У NT это пробирка «B», у ZFPoff — пробирка «A»; у CRISPRoff в этом наборе буква не проставлена (одна пробирка на реплику).
- M (цифра после «.») — технический EM-seq повтор. Один и тот же биологический материал прогнали через EM-seq-пайплайн дважды (.1 и .2), независимо, чтобы проверить техническую воспроизводимость самого измерения — а не биологии.
| Образец | Биол. реплика | Пробирка | Технич. повтор |
|---|---|---|---|
| Coff_1.1 | 1 | — | 1 |
| Coff_1.2 | 1 | — | 2 |
| NT_1B.1 | 1 | B | 1 |
| NT_1B.2 | 1 | B | 2 |
| NT_3B.1 | 3 | B | 1 |
| NT_3B.2 | 3 | B | 2 |
| ZFP_1A.1 | 1 | A | 1 |
| ZFP_1A.2 | 1 | A | 2 |
| ZFP_3A.1 | 3 | A | 1 |
| ZFP_3A.2 | 3 | A | 2 |
Асимметрия в таблице честная, не ошибка оформления: у CRISPRoff нет буквы пробирки в этом наборе, а биологическая реплика 2 не представлена ни в одном условии — так решили в лаборатории при подготовке именно этого EM-seq-прогона.
Глобальный % метилирования CpG (EM-seq, объединены реплики)
Взвешенное среднее по всем 91 CpG-позициям: сумма метилированных прочтений делённая на сумму метилированных+неметилированных — честная доля, не «наивная» floor-оценка.
| Условие | % метилирования CpG | Покрытие/позицию |
|---|---|---|
| NT | 4.9% | 39–1400× |
| CRISPRoff | 62.7% | ≈800–840× |
| ZFPoff | 66.0% | ≈1800–3300× |
Статистика по каждому CpG (Fisher's exact + BH-коррекция)
| Сравнение | Значимо (q<0.05) |
|---|---|
| CRISPRoff vs NT | 91 / 91 |
| ZFPoff vs NT | 90 / 91 |
| CRISPRoff vs ZFPoff | 79 / 91 |
CpH-метилирование во всех образцах 0.02–0.22% — конверсия чистая, фонового шума нет.
Сходится ли EM-seq с Nanopore на этом же доноре?
Данные Day 35 ONT (Unedited/NT и CRISPRoff, порог вызова 0.7) взяты напрямую из epiCode/epiEditData/T_cells/Day_35 — тот же донор, тот же день, что и EM-seq выше.
| Условие | EM-seq (честная доля) | ONT Day 35 (наивная floor-оценка) | N молекул (ONT) |
|---|---|---|---|
| NT / Unedited | 4.9% | 19.7% | 202 (87 FWD + 115 RVS) |
| CRISPRoff | 62.7% | 58.7% | 326 (104 FWD + 222 RVS) |
| Δ (CRISPRoff − NT) | +57.8 п.п. | +39.0 п.п. | — |
Как читать это расхождение
CRISPRoff сходится хорошо: 62.7% (EM-seq, честная доля метилированных среди всех прочтений) против 58.7% (ONT, наивная оценка) — две независимые химии (ферментативная конверсия + короткое прочтение против прямого одномолекульного вызова Nanopore) в пределах ~4 процентных пунктов друг от друга. Это сильная ортогональная проверка того, что CRISPRoff действительно откладывает метилирование на этом окне у этого донора на 35-й день.
NT/Unedited расходится сильно: 4.9% (EM-seq) против 19.7% (ONT) — на первый взгляд похоже на проблему. Но у ONT-массива в имени файла стоит filterMode10_NoFullyUnmeth — из него уже исключены полностью-неметилированные молекулы ещё до подсчёта наивной доли (nansum(a)/a.size). Для NT-условия, где истинное метилирование действительно низкое, этот фильтр выбрасывает подавляющее большинство молекул и оставляет смещённый вверх остаток — именно поэтому и разница CRISPRoff−NT в ONT (+39.0) меньше, чем в EM-seq (+57.8): не потому что эффект CRISPRoff слабее, а потому что база NT в ONT завышена фильтром.
NoFullyUnmeth для NT, либо явный пересчёт «доли среди вызванных» вместо floor-оценки. Пока это не сделано — сравнивайте CRISPRoff-к-CRISPRoff между методами, а не абсолютные NT-числа.Обе кривые растут на первых ~20 и последних ~15 CpG-индексах независимо от условия — похоже на фон вне зоны прямого действия CRISPRoff/ZFPoff, тот же паттерн виден и в EM-seq-профиле (первая позиция ампликона тоже почти всегда метилирована). Индексация CpG в ONT-окне (137, T2T-CHM13v2.0) и локальная нумерация позиций в EM-seq-ампликоне (91) не выровнены геномными координатами напрямую — сопоставление 1:1 не сделано, это качественное наблюдение, а не количественная проверка позиции.
Ещё четыре сравнения EM-seq и ONT
Помимо глобального итога, ниже — то же самое NT/CRISPRoff сравнение под другими углами: своя статистика значимости для ONT, форма распределения эффекта, грубая проверка формы профиля без привязки к координатам, и честный отчёт о попытке выровнять профили по позиции.
1. Своя статистика значимости для ONT (наивная)
Тот же тест — Fisher's exact + BH — применённый к ONT-массивам напрямую: «метилировано» = число 1 в позиции, «не метилировано» = всё остальное (включая NaN — то есть неопределённые и отфильтрованные молекулы, не только честные 0). Это тот же наивный floor-подход, что и в глобальном итоге, только по каждому CpG отдельно.
| Метод | Сравнение | Значимо (q<0.05) |
|---|---|---|
| EM-seq | CRISPRoff vs NT | 91 / 91 |
| ONT (наивно) | CRISPRoff vs NT | 118 / 137 |
Числа не строго сопоставимы: разное общее число CpG (91 против 137) и разное определение «не метилировано» — у EM-seq это честный явный 0, у ONT это NaN, куда попадают и неопределённые вызовы, и отфильтрованные NoFullyUnmeth-молекулы. Но оба метода сходятся в главном: у подавляющего большинства CpG на этом окне CRISPRoff статистически отличим от NT.
2. Форма распределения эффекта Δ(CRISPRoff − NT)
Не только средний эффект, а его разброс по 91/137 позициям — совпадает ли форма распределения, а не только итоговое число.
| Метод | Среднее | Медиана | IQR (25–75%) | Мин…Макс |
|---|---|---|---|---|
| EM-seq | +58.3 п.п. | +58.5 | +41.9…+82.8 | −3.6…+96.6 |
| ONT (наивно) | +39.0 п.п. | +42.7 | +18.7…+57.8 | −9.9…+85.4 |
Оба распределения сдвинуты далеко вправо от нуля и имеют похожий размах (~90–100 п.п. от минимума до максимума) — качественно одна и та же картина: почти на каждом CpG CRISPRoff поднимает метилирование, с широким разбросом по величине эффекта. Абсолютный сдвиг у ONT ниже во всём распределении — той же самой инфляции NT-базы фильтром NoFullyUnmeth, что и в глобальном итоге.
3. Грубая проверка формы профиля — по третям, без привязки к координатам
Раз точное сопоставление CpG-позиций между методами не сделано, можно сравнить хотя бы форму: разбить каждый профиль на три равные по числу CpG части (первая/средняя/последняя треть по порядку) и посмотреть среднее метилирование в каждой.
| Условие | 1-я треть | средняя треть | 3-я треть |
|---|---|---|---|
| EM-seq · NT | 12.9% | 0.3% | 0.2% |
| EM-seq · CRISPRoff | 61.5% | 67.3% | 59.4% |
| EM-seq · ZFPoff | 55.0% | 73.0% | 72.5% |
| ONT · NT | 44.2% | 2.0% | 13.4% |
| ONT · CRISPRoff | 66.1% | 61.3% | 48.9% |
Совпадает: у NT в обоих методах середина профиля — почти пустая (0.3% и 2.0%), а первая треть заметно выше (12.9% и 44.2%) — то же качественное «высокий край, пустая середина», что видно и на графиках выше.
Не совпадает: последняя треть NT — у EM-seq почти ноль (0.2%), у ONT заметно выше (13.4%). У CRISPRoff EM-seq держится ровно по всем третям (61–67%), а ONT спадает к концу (66%→49%). Это ожидаемо: без сопоставления координат «первая треть» в 91-позиционном ампликоне EM-seq и «первая треть» в 137-позиционном окне ONT — не обязательно один и тот же участок промотора.
4. Попытка выровнять профили по относительной позиции — и почему она не сработала
Самый прямой способ проверить совпадение формы — интерполировать оба профиля Δ(CRISPRoff−NT) на общую ось «относительная позиция в ампликоне, 0–100%» (позиция EM-seq делённая на длину ампликона, индекс ONT делённый на 137) и посчитать корреляцию.
| Метрика | Значение |
|---|---|
| Pearson r | −0.008 (p = 0.94) |
| Spearman ρ | −0.123 (p = 0.24) |
Облако точек без выраженного тренда — визуальное подтверждение того же нулевого результата: точки не выстраиваются по диагонали, как было бы при настоящем совпадении позиций.
5. Прямые оверлеи по условиям — EM-seq и ONT на одном графике
То же самое, что графики выше, но раздельно: NT, CRISPRoff и ZFPoff — каждый на своей оси, с обоими методами сразу. Ось X — та же относительная позиция 0–100%, что и в пункте 4 (не геномная координата — см. оговорку выше). Метод отличается стилем линии: EM-seq — сплошная толстая линия, ONT — пунктир с точками-маркерами.
Визуальное сходство формы (высокий край / провал в середине у NT; ровный высокий уровень у CRISPRoff и ZFPoff) — качественное наблюдение, не количественное совпадение позиций: пункт 4 выше уже показал, что корреляция по этой самой оси практически нулевая. ZFPoff показан только по EM-seq, потому что ONT-массив для ZFPoff на Day 35 ещё не загружен на эту страницу.
Что это добавляет к общей картине
Основной результат Day 35 — что CRISPRoff молчит CD55 через метилирование промотора — теперь подтверждён вторым, полностью независимым способом измерения (EM-seq, без Nanopore) на том же самом доноре и дне. Это не просто ещё один прогон того же пайплайна — другая химия конверсии, другая платформа секвенирования, другой вызов метилирования.
Как бонус — тот же эксперимент включает ZFPoff (66.0%), вторую систему молчания без сайт-специфичной sgRNA, которая на этом ампликоне выглядит не слабее CRISPRoff, а местами сильнее.