Write → Read → Learn · чтение локуса

Почему CRISPRoff метилирует не все CpG одинаково?

Наши профили метилирования CD55 не плоские. Одни CpG уходят из почти нулевого уровня в сильное метилирование, а соседи в 30 п.н. едва двигаются. Здесь собраны публичные доказательства — транскрипционные факторы на TSS CD55, архитектура хроматина и собственная химия DNMT3A — и превращены в семь механизмов, которые можно реально проверить на таблице из 137 CpG, которая у нас уже есть.

Промотор CD55 в масштабе

An и соавт. (2024) картировали пять парных элементов CACCC (KLF) в промоторе CD55 человека и с помощью ChIP показали, что KLF4, фосфо-CREB и CBP сидят на трёх из них, расположенных рядом с сайтами CRE. Их позиции относительно старта транскрипции: −106/−95, −228/−214, −310/−302, −567/−549 и −667/−652; три сайта рядом с CRE обозначены A (−106/−95), B (−310/−302) и C (−667/−652). Сам старт транскрипции лежит на 81 п.н. ниже TATA-бокса.

Поверх этого — наш собственный дифференциальный сигнал: непрерывный значимый блок на CpG #20–132 (от −1077 до +1935 относительно TSS) и самый резкий пик на CpG #78–83 (+58…+84).

Гайд на карте

Спейсер CRISPRoff — GCTGCGACTCGGCGGAGTCC, он ложится на GRCh38 chr1:207 321 713–207 321 732 — +93…+112 относительно TSS. Координаты в T2T, которые были даны вместе с ним (chr1:206 587 009–206 587 028), отличаются ровно на 734 704 п.н. на обоих концах — это перепроверяет liftover и даёт TSS в T2T на chr1:206 586 916.

Это единственное число меняет картину. Наши самые резкие дифференциальные CpG, #78–83, идут от +58 до +84 — они обрываются за 9 п.н. до начала протоспейсера. Самый сильный сигнал во всём профиле сидит сразу за пределами следа самого редактора, с 5′-стороны — ровно там, где литература по dCas9–DNMT3A предсказывает боковой максимум.

Семь механизмов неровного профиля

В каждой карточке: в чём механизм, какие есть публичные доказательства, что он предсказывает для нашего профиля CD55, и как это проверить на данных, которые у нас уже есть. Разверните, чтобы прочитать.

M1След самого редактора

Механизм

dCas9 вместе с R-петлёй занимает примерно 20–30 п.н. ДНК. Привязанный каталитический модуль DNMT3A/3L дотягивается от этого якоря наружу, поэтому фермент не может действовать на ДНК, на которой сам сидит, — он действует на ближайшую свободную ДНК по обе стороны.

Доказательства

Stepper и соавт. измерили это напрямую для dCas9–Dnmt3a3L: 20–30 п.н. под dCas9 остаются практически неметилированными, а самое сильное метилирование ложится по обе стороны — примерно на 25 п.н. с одного фланга PAM и около 40 п.н. с другого. Независимое исследование dCas9–DNMT3A нашло полосу активности шириной 25–35 п.н. с центром примерно в 27 п.н. ниже PAM по цепи.

Предсказывает

Воспроизводимый провал на протоспейсере с плечами по бокам, на фиксированных расстояниях от PAM — самая предсказуемая с точки зрения геометрии деталь во всём профиле. Она должна быть в CRISPRoff и отсутствовать или сидеть иначе в ZFPoff, у которого след цинкового пальца другого размера и на другой последовательности.

Проверка на наших данных

Спейсер теперь картирован — GRCh38 chr1:207 321 713–207 321 732, то есть +93…+112 от TSS (разобрано здесь). Перестройте Δметилирования относительно расстояния от PAM вместо расстояния от TSS и проверьте три CpG внутри протоспейсера на провал. Наш наблюдаемый пик обрывается за 9 п.н. до протоспейсера — это уже предсказанная геометрия. Новое секвенирование не требуется.

M2Предпочтения DNMT3A по последовательности

Механизм

Каталитический домен контактирует с несколькими основаниями по обе стороны от целевого CpG. Одни фланки — отличный субстрат, другие — почти неподдающийся, независимо от хроматина, позиции или способа таргетирования.

Доказательства

Углублённые энзимологические работы показали, что основания от −2 до +8 меняют скорость реакции более чем на два порядка: на −2 предпочтителен тимин, на −1 — цитозин или аденин, на +1…+3 — цитозин, а гуанин почти везде нежелателен. По всему геному DNMT3A лучше всего работает на TACGYC, а DNMT3B — на TACGRC, и это предпочтение сохраняется независимо от того, куда в геноме рекрутирован фермент. Более раннее эписомальное исследование оценило эффект в 34-кратный разброс между отдельными сайтами, который для DNMT3A задают основания на −2 и +2.

Предсказывает

Δметилирования по каждому CpG должна коррелировать с фланкирующей последовательностью ±2, причём пиримидин на +2 должен работать лучше. Поскольку CRISPRoff несёт DNMT3A (не 3B), фланки типа CGC/CGT должны опережать CGG/CGA.

Проверка на наших данных

Извлечь из референса контекст ±3 п.н. для всех 137 CpG, закодировать каждый сайт по основанию на +2 и сравнить Δметилирования между четырьмя группами. Это анализ на один вечер, и это самый сильный доступный контроль «профиль не случаен» — положительный результат объяснит реальную долю дисперсии ещё до всяких аргументов про хроматин.

M3Нуклеосомы, линкеры и период 10 п.н.

Механизм

De novo метилирование происходит преимущественно на ДНК между нуклеосомами, а геометрия димера DNMT3A вместе с поворотом спирали ДНК делает так, что одни CpG смотрят наружу (доступны), а другие — внутрь (экранированы).

Доказательства

Структура Dnmt3a–Dnmt3L предполагает, что димер Dnmt3a может дотянуться до двух CpG, разделённых одним витком спирали, за одно событие связывания — это проявляется как периодическая рябь относительного метилирования вдоль ряда сайтов. Недавняя крио-ЭМ вместе с биохимией показала, что расстояние между нуклеосомами задаёт метилирование линкера: короткие линкеры позволяют комплексу «мостить» две нуклеосомы и перекрывать ДНК между ними, а длинные линкеры дают ему взаимодействовать с каждой нуклеосомой по отдельности и метилировать линкер. Сама геометрия нуклеосомы даёт периодический паттерн стерических столкновений, совпадающий с 10-п.н. периодом спирали, в пользу CpG, чьи основания смотрят от гистонового кора наружу.

Предсказывает

Остаточная периодичность ~10 п.н. в профиле Δ по CpG после вычитания эффектов расстояния до PAM и фланкирующей последовательности; и участки с низким метилированием шириной примерно 150 п.н., соответствующие хорошо позиционированным нуклеосомам.

Проверка на наших данных

Автокорреляция или периодограмма Ломба–Скаргла для Δметилирования относительно геномной позиции (расстояния между CpG нерегулярны, поэтому нужен метод, устойчивый к неравномерной выборке). Честная оговорка: эписомальное исследование не нашло значимой связи между расстоянием между CpG и эффективностью метилирования — сайты в 8–10 п.н. друг от друга метилировались не лучше остальных. Так что это по-настоящему открытый вопрос, а не устоявшееся предсказание.

M4Транскрипционные факторы на пути

Механизм

Связанный транскрипционный фактор — это стерическая преграда, а некоторые факторы вдобавок привлекают ферменты TET. В любом случае занятый мотив обычно остаётся гипометилированным относительно окружения — классический «след» в профиле метилирования.

Доказательства

Связывание ТФ влияет на локальное метилирование и физически блокируя метилтрансферазу, и приводя ферменты TET к месту связывания. Именно на CGI устойчивость ооцитов к de novo метилированию совпадает с CGCGC — сайтом узнавания E2f1/E2f2 — независимо от активности промотора, H3K4me3, Cfp1 или потенциала R-петель: чистая демонстрация того, что один мотив может обеспечивать защиту. Футпринтинг на одиночных молекулах показывает, что связь скорее сайт-специфична, чем универсальна: антикорреляция между 5mC и связыванием ТФ проявляется лишь на части сайтов связывания по геному.

Предсказывает

Локальные провалы на сайтах KLF A/B/C и соседних с ними CRE — то есть около −106/−95, −310/−302 и −667/−652 — в донорских T-клетках, где заняты KLF4 и CREB. В наших данных соседние с KLF CpG #35, #54 и #65 лежат в пределах ~15 п.н. от трёх опубликованных сайтов CACCC.

Проверка на наших данных

Аннотировать каждый из 137 CpG расстоянием до ближайшего опубликованного элемента KLF/CRE, затем проверить, систематически ли менее отзывчивы на CRISPRoff CpG рядом с мотивами. Поскольку уровень активации меняет уровень KLF4 в T-клетках (см. ниже), это предсказывает эффект, зависящий от донора и стимуляции — что можно проверить, сравнив Day 6 и Day 35.

M5Уже существовавшее состояние хроматина

Механизм

DNMT3A «читает» гистоны через два домена: домен ADD отталкивается от H3K4me3 (метки, покрывающей активные промоторы), а домен PWWP притягивается к H3K36me2/3. Поэтому активный, богатый H3K4me3 промотор CD55 по своей природе враждебная территория для фермента, и CRISPRoff приходится это преодолевать — неравномерно.

Доказательства

H3K4me3 не подпускает de novo метилтрансферазы к неметилированным CpG-островкам, а H3K36me3 притягивает DNMT3B в транскрибируемые тела генов. В работе на динуклеосомах показано, что когда комплекс мостит две близко расположенные нуклеосомы, его домены PWWP больше не могут сканировать H3K36me2 — это добавляет ещё одно структурное ограничение. Именно домен KRAB в составе CRISPRoff это меняет: KRAB связывает TRIM28, который привлекает машинерию гетерохроматина и откладывает H3K9me3, а митотически наследуемая часть сайленсинга CRISPRoff держится на плече ДНК-метилирования.

Предсказывает

Самый крутой сигнал H3K4me3 — прямо на TSS — должен метилироваться труднее всего на раннем этапе, а фланки и «берега» должны переключаться первыми, с последующим заполнением. Наш пик сидит чуть ниже TSS по цепи, на +58…+84, что совместимо и с «плечом пика H3K4me3», и с «плечом следа dCas9» (M1) — эти два варианта нужно разделить.

Проверка на наших данных

Наложить публичные H3K4me3, H3K27ac и H3K9me3 для CD4⁺/CD8⁺ T-клеток человека (BLUEPRINT, Roadmap, ENCODE) на окно CD55 и сопоставить сигнал с Δ по каждому CpG. Также сравнить Day 6 и Day 35: если этот механизм доминирует, порядок переключения CpG должен следовать уже существовавшему градиенту хроматина.

M6Стирание и сбои поддержания

Механизм

Метилирование, записанное на нулевой день, должно пережить репликацию (DNMT1 на полуметилированной цепи) и активное удаление (окисление TET до 5hmC и дальше). Ни один из этих процессов не идёт равномерно вдоль локуса, поэтому метка, записанная ровно, может считываться неровно недели спустя.

Доказательства

Собственный инструмент реверсии CRISPRoff работает именно так: память можно стереть с помощью CRISPRon, который снимает метилирование и заново привлекает транскрипционную машинерию. Локализация DNMT3A1 связана с оборотом метки: её связывание совпадает с повышенным 5-гидроксиметилцитозином, что указывает на активный оборот, а не статичную метку в этих сайтах.

Предсказывает

Позиции, теряющие метилирование между Day 6 и Day 35, — это другой, отличимый набор от позиций, которые вообще не метилировались. «Никогда не записано» и «записано и потом стёрто» — это разные сигнатуры.

Проверка на наших данных

У нас уже есть сравнение Day 6 vs Day 35 — но там донор смешан (confounded) с временной точкой, поэтому текущий дизайн не позволяет разделить это чисто. Нужна временная серия на одном и том же доноре. Это стоит пометить как открытый вопрос, а не выдавать за результат. Прогон нанопора, который вдобавок вызывает 5hmC, разделил бы «стёрто» и «никогда не записано» напрямую.

M7Молекулы, а не средние

Механизм

Среднее по каждому CpG схлопывает два очень разных мира: градуированное частичное метилирование на каждой молекуле — против переключателя «всё или ничего», присутствующего на части молекул. Только второй вариант совместим с переключательным характером сайленсинга, который даёт CRISPRoff.

Доказательства

Футпринтинг на одиночных молекулах существует именно поэтому: такие энхансеры сидят сразу в двух состояниях — на части молекул ДНК метилирована и покрыта нуклеосомой, на остальных — в альтернативной конфигурации. Футпринтинг промоторов метилтрансферазой точно так же даёт разрешение до отдельных молекул промотора, сохраняя связь между сайтами на одной и той же молекуле, и вскрывает положения нуклеосом, которые нуклеазные методы размывают в одно целое.

Предсказывает

Бимодальное распределение долей метилирования по молекулам в окне CD55, где две моды соответствуют отредактированным и «ускользнувшим» молекулам — и коррелированное состояние метилирования вдоль отдельной молекулы, а не независимые «подбрасывания монеты» по каждому CpG.

Проверка на наших данных

Вот для чего на самом деле нужна наша платформа. Кластеризовать молекулы по полному бинарному вектору из 137 CpG вместо усреднения по столбцам; проверить долю mCpG на молекулу на бимодальность; посчитать попарное со-метилирование между CpG i и CpG j на одном и том же риде как функцию их расстояния. Длина затухания корреляции — это прямое, не зависящее от модели измерение того, как далеко распространяется домен сайленсинга на одной хромосоме, — и ничего подобного из литературы по массовому бисульфиту получить нельзя.

Транскрипционные факторы, описанные на промоторе CD55

Что реально опубликовано, отранжировано по тому, насколько доказательства напрямую относятся к T-клеткам человека. Почти вся механистическая работа сделана на эндотелиальных клетках, эпителии или линиях рака толстой кишки — колонка про T-клетки как раз показывает честные пробелы.

Почему T-клеточный контекст меняет предсказание

CD55 в T-клетках — не пассажир

Это регулятор тех самых клеток, которые мы редактируем. CD55 задаёт, насколько громко работает аутокринная сигнализация рецепторов C3a/C5a: при низком CD55 эта сигнализация усиливается и запускаются эффекторные ответы; при высоком CD55 сигнализация приглушена и предпочтение отдаётся коммитированию в Foxp3⁺ регуляторные клетки. Независимо от этого, вовлечение CD55 вместе с CD3 — сшивающим антителом или естественным лигандом CD97 — повышает пролиферацию человеческих T-клеток CD4⁺ из крови вместе с CD69, CD25, IL-10 и GM-CSF.

Отсюда два следствия для нас. Во-первых, сайленсинг CD55 — это функциональное возмущение, а не нейтральное считывание: отредактированные клетки могут смещаться к эффекторному фенотипу, а это меняет набор ТФ, который затем формирует метилирование. Во-вторых, KLF4 и CD55 падают вместе при активации, поэтому занятость промотора факторами в момент действия CRISPRoff зависит от того, как были простимулированы донорские клетки.

Метилирование и связывание ТФ работают в обе стороны

Обычная история — метилирование блокирует ТФ. Систематический ответ более запутанный, и эта запутанность особенно важна для T-клеток: скрининг 542 человеческих ТФ методом methyl-SELEX выявил большую группу, которая на самом деле предпочитает метилированный CpG, — в основном в расширенном семействе homeodomain, где 5-метильная группа образует прямой гидрофобный контакт. В разбивке по семействам связывание bHLH, bZIP и ETS в целом подавлялось метилированием CpG за счёт стерического конфликта, а факторы homeodomain, POU и NFAT предпочитали именно метилированный вариант.

То, что NFAT предпочитает метилированный CpG, — примечательная деталь именно для T-клеточного локуса. Это значит, что метка, которую откладывает CRISPRoff на CD55, не просто всех выселяет — она может перераспределить, какие факторы вообще способны сесть на участок. Есть ли в нашем окне мотив NFAT — это именно то, что нужно проверить в JASPAR/UniBind, а не предполагать.

Плечо KRAB важно не меньше плеча DNMT

KRAB связывает TRIM28 — повсеместный каркасный белок, который привлекает машинерию гетерохроматина и запускает H3K9me3; CRISPRoff превосходит и один dCas9-KRAB (сильный, но временный эффект), и один dCas9-DNMT3A/3L (слабый, но наследуемый) — именно поэтому важен мультидоменный дизайн. Пространственный охват распространения H3K9me3 и пространственный охват метилирования CpG не обязаны совпадать, и там, где они расходятся, это информативно. Nuñez и соавт. использовали именно эту логику: широкое окно таргетирования на промоторе H2B позволило проследить, как устанавливаются, распространяются и поддерживаются H3K9me3 и метилирование CpG.

Публичные данные, которые стоит скачать для этого окна

Всё ниже покрывает либо локус CD55 в T-клетках, либо механистические параметры, нужные моделям выше. В запросах использовать chr1:207 318 092–207 324 450 (GRCh38) с отступом ~5 kb.

Запускать там, где есть сеть. Скрипт вырезает окно CD55 из удалённых bigWig и BED вместо скачивания файлов на весь геном. URL-акцешены с порталов ENCODE/BLUEPRINT нужно подставить самому — они меняются, поэтому скрипт специально держит их в одном редактируемом блоке сверху.

#!/usr/bin/env bash
# окно промотора CD55 — скачать публичные T-клеточные треки (GRCh38)
set -euo pipefail

CHR=chr1; START=207313000; END=207329000        # ампликон +/- ~5 kb
REGION="${CHR}:${START}-${END}"
OUT=cd55_public; mkdir -p "$OUT"; cd "$OUT"

# ---- 1. референсная последовательность окна (анализ фланков, M2) ----
samtools faidx /path/to/GRCh38.fa "$REGION" > cd55_window.fa

# ---- 2. перечислить все CpG в окне с их контекстом +/-3 п.н. ----
python3 - <<'PY'
from pathlib import Path
seq = "".join(l.strip() for l in Path("cd55_window.fa").read_text().splitlines()[1:]).upper()
start = 207313000  # держать в синхроне с $START выше; координаты faidx 1-based
rows = []
for i in range(3, len(seq) - 4):
    if seq[i:i+2] == "CG":
        rows.append((start + i, seq[i-3:i+5], seq[i+2]))   # позиция, контекст, база на +2
Path("cd55_cpg_context.tsv").write_text(
    "pos\tcontext_m3_p4\tplus2_base\n" + "\n".join(f"{p}\t{c}\t{b}" for p, c, b in rows)
)
print(f"{len(rows)} CpG записано")
PY

# ---- 3. треки хроматина: подставить URL и вырезать окно удалённо ----
declare -A TRACKS=(
  [CD4_H3K4me3]="https://www.encodeproject.org/files/ENCFFxxxxxx/@@download/ENCFFxxxxxx.bigWig"
  [CD4_H3K27ac]="https://www.encodeproject.org/files/ENCFFxxxxxx/@@download/ENCFFxxxxxx.bigWig"
  [CD4_H3K9me3]="https://www.encodeproject.org/files/ENCFFxxxxxx/@@download/ENCFFxxxxxx.bigWig"
  [CD4_ATAC]="https://www.encodeproject.org/files/ENCFFxxxxxx/@@download/ENCFFxxxxxx.bigWig"
)
for name in "${!TRACKS[@]}"; do
  bigWigToBedGraph -chrom="$CHR" -start="$START" -end="$END" "${TRACKS[$name]}" "${name}.bedGraph"
done

# ---- 4. поиск мотивов (M4) ----
# один раз скачать файл JASPAR CORE vertebrates в формате MEME, затем:
#   fimo --thresh 1e-4 --oc fimo_out JASPAR2024_CORE_vertebrates.meme cd55_window.fa

echo "done -> $(pwd)"

Шесть анализов в порядке выполнения

Порядок — по соотношению пользы к усилиям. Первые три не требуют вообще никаких новых данных.

Чем эта страница не является

• Не результат. Ни один трек не был скачан, ни одно число здесь не вычислено. Каждый механизм — гипотеза с прописанным способом проверки.
• Не T-клеточные доказательства для сайтов ТФ. Картирование KLF4/CREB/CBP сделано на эндотелии и репортёрных конструкциях. Перенос на первичные T-клетки человека — допущение, пока T-клеточный ChIP не скажет обратного.
• Не полный список факторов. Отсутствие NFAT, ETS или RUNX в таблице отражает отсутствие T-клеточных исследований этого промотора, а не отсутствие связывания.
• Не решение проблемы смешения донора и временной точки. Day 6 и Day 35 — разные доноры; в частности, M6 нельзя закрыть при текущем дизайне.
• С координатами нужна аккуратность. Наши выравнивания на T2T-CHM13v2.0; почти всё, на что здесь есть ссылки, — GRCh38. Делать liftover осознанно и проверять, что TSS ложится туда, где ожидается, прежде чем что-либо накладывать.

Источники

1. An F-Q, Zhou G, Harland MT, et al. KLF4 and CD55 expression and function depend on each other. Front Immunol 2024;14:1290684. PMC10884306 — координаты сайтов CACCC/CRE, ChIP по KLF4/p-CREB/CBP, данные по активации CD4⁺.
2. Nuñez JK, Chen J, Pommier GC, et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell 2021. Article — механизм CRISPRoff, окно таргетирования, таблицы DMR по WGBS.
3. Stepper P, Kungulovski G, Jurkowska RZ, et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9–Dnmt3a–Dnmt3L. Nucleic Acids Res 2017;45:1703. Article — защитный след dCas9 и боковые пики метилирования.
4. Vojta A, Dobrinić P, Tadić V, et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Res 2016;44:5615. Article — пик метилирования 25–35 п.н. с центром в 27 п.н. от PAM.
5. Adam S, Bräcker J, Klingel V, et al. DNMT3A forms interaction networks with the CpG site and flanking sequence elements. J Biol Chem 2022. Article — эффекты фланкирующей последовательности >100-кратные, по каждой позиции.
6. Mallona I, Ilie IM, Karemaker ID, et al. Flanking sequence preference modulates de novo DNA methylation in the mouse genome. Nucleic Acids Res 2021;49:145. Article — TACGYC против TACGRC.
7. Wienholz BL, Kareta MS, Moarefi AH, et al. DNMT3L modulates flanking sequence preference for DNMT3A/3B in vivo. PLoS Genet 2010;6:e1001106. Article — отбор по −2/+2; также отрицательный результат по расстоянию между CpG.
8. Jia D, Jurkowska RZ, Zhang X, et al. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature 2007. PMC2712830 — модель периодичности ~10 п.н.
9. Nucleosome spacing regulates linker methylation by DNMT3A2/3B3. Mol Cell 2026. Article — длина линкера как управляющая переменная; распознавание H3K36me2 блокируется мостиком между нуклеосомами.
10. Structural DNMT–nucleosome contacts are related to DNA methylation patterns. PMC12427118 — предпочтение CpG, смотрящих наружу, и стерическая волна 10 п.н.
11. Manzo M, Wirz J, Ambrosi C, et al. Isoform-specific localization of DNMT3A regulates methylation fidelity at bivalent CpG islands. EMBO J 2017. PMC5709737 — исключение по H3K4me3, оборот 5hmC.
12. Kreibich E, Kleinendorst R, Barzaghi G, et al. Single-molecule footprinting identifies context-dependent regulation of enhancers by DNA methylation. Mol Cell 2023. Article — двойные состояния, связь 5mC–ТФ только на части сайтов.
13. Fatemi M, Pao MM, Jeong S, et al. Footprinting of mammalian promoters with a CpG methyltransferase. PMC1292996 — принцип футпринтинга промотора на одиночных молекулах.
14. Yin Y, Morgunova E, Jolma A, et al. Impact of cytosine methylation on DNA binding specificities of human transcription factors. Science 2017;356:eaaj2239. Article — methyl-SELEX по 542 ТФ.
15. Li L, Zhang Y, Wang J, et al. The genetic and epigenetic regulation of CD55 and its pathway analysis in colon cancer. Front Immunol 2022. PMC9889927 — TFCP2 и NF-κB на промоторе CD55.
16. Capasso M, Durrant LG, Stacey M, et al. Costimulation via CD55 on human CD4⁺ T cells mediated by CD97. J Immunol 2006. PMID 16818763.
17. Calderon D, Nguyen MLT, Mezger A, et al. Landscape of stimulation-responsive chromatin across diverse human immune cells. Nat Genet 2019. Article · GSE118189.
18. Ewulonu UK, Ravi L, Medof ME. Characterization of the decay-accelerating factor gene promoter region. PNAS 1991;88:4675. PMC51728 — позиционирование TATA-бокса и TSS.