ZFPoff и CRISPRoff: одна мишень, разные носители

Два эпигеномных редактора нацелены практически на одну и ту же точку промотора CD55, но доставляются разными белками. Здесь собрано, чем они различаются по конструкции и что говорят наши данные секвенирования.

0. Честное сравнение: обе системы на одних клетках

Это единственный набор, где ZFPoff и CRISPRoff измерены бок о бок — те же первичные T-клетки того же донора, тот же 35-й день, та же химия. Здесь величины эффекта сравнимы напрямую, в отличие от нанопоровых данных ниже.

По каждому CpG отдельно: доля метилированных ридов в каждой группе. Ничего не усреднено, покрытие от 183 до 3300 ридов на позицию.

Футпринт подтверждён второй химией

Индекс защиты по каждому CpG внутри и вокруг мишеней. Обе системы дают провал, начинающийся у 5′-края своей мишени, и ширины совпали с нанопоровыми с точностью до пары оснований.

1. Конструкт: та же начинка, разный носитель

Оба конструкта несут одинаковый набор рабочих доменов — метилтрансферазу Dnmt3A/L, флуоресцентную метку BFP и репрессорный домен KRAB. Отличается только модуль, который находит мишень: dCas9 с направляющей РНК или белок с цинковыми пальцами.

2. Мишени перекрываются на 14 из 20 п.н.

Это важно для интерпретации: раз обе системы садятся практически в одну точку, различия в результате нельзя списать на разное расположение мишени.

3. Профили метилирования почти совпадают по форме

По каждому из 137 CpG посчитана разница в доле метилированных молекул между отредактированной и контрольной группой. Профили ZFPoff и CRISPRoff коррелируют между собой почти так же сильно, как две независимые временные точки CRISPRoff между собой.

4. Футпринт есть у обеих систем — но разной ширины

CpG прямо под белком получают меньше метилирования, чем соседние: комплекс физически закрывает к ним доступ. Это видно у обеих систем, и обе начинаются с одного и того же CpG 74 — это 5′-край общей мишени. Различается протяжённость: у ZFPoff провал обрывается через 8 пар оснований, у CRISPRoff тянется на 19–22.

5. Попарные сравнения наборов, CpG за CpG

Здесь каждая точка — один из 137 CpG. Ничего не усреднено: по горизонтали его прирост метилирования в одном наборе, по вертикали в другом. Диагональ — линия равенства; точки выше неё означают, что второй набор дал больше на этом CpG.

Разность по каждому CpG отдельно — видно, где именно наборы расходятся, а не насколько они похожи в среднем.

6. Что из этого следует и чего мы не знаем

Откуда взяты ожидаемые длины

Каждое число, с которым сравниваются наши измерения, взято из опубликованной работы, а не из общих соображений.

• 1

  Pavletich N.P., Pabo C.O. Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268–DNA complex at 2.1 Å

  Science 252(5007):809–817, 1991 · 10.1126/science.2028256

  Кристаллическая структура трёх пальцев Zif268 на ДНК: каждый палец связывается в большой бороздке и контактирует с подсайтом из трёх пар оснований. Отсюда правило «3 п.н. на палец», из которого следует 20 п.н. для конструкции из шести-семи пальцев.

• 2

  Nishimasu H. et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA

  Cell 156(5):935–949, 2014 · PDB 4OO8 · 10.1016/j.cell.2014.02.001

  Двулопастная архитектура SpCas9: гетеродуплекс из 20 пар оснований лежит в канале между долями, а PAM-связывающий домен на C-конце удерживает PAM-дуплекс отдельно. Отсюда 20 п.н. протоспейсера плюс 3 п.н. PAM как минимальная область контакта.

• 3

  Yang M. et al. The post-PAM interaction of RNA-guided spCas9 with DNA dictates its target binding and dissociation

  Science Advances 5(9):eaaw9807, 2019 · 10.1126/sciadv.aaw9807

  Прямое измерение занятости ДНК одиночными молекулами. Авторы отмечают расхождение: по кристаллической структуре Cas9 накрывает лишь несколько пар оснований за PAM, тогда как атомно-силовая микроскопия давала более широкий след. Наши 28 п.н. ложатся в этот интервал.